CONTROL DE PLAGAS AGRÍCOLAS CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

 

 

AGRICULTURAL PEST CONTROL WITH ENTOMOPATHOGENIC FUNGI

Yolanda Escamilla-Lozano, María José Serrano-Maldonado, Alejandro Angel-Cuapio

Tecnologico de Estudios Superiores del Oriente del Estado de México. División de Ingeniería Ambiental, Paraje de San Isidro S/N, Barrio de Tecamachalco, 56400, Los Reyes Acaquilpan, Estado de México.

Universidad Autónoma Metropolitana-Unidad Iztapalapa. Departamento de Biotecnología. San Rafael Atlixco 186, Vicentina, 09340, Iztapalapa, Ciudad de México.

 

RESUMEN.

 

La aplicación controlada de agentes de control biológico tales como: bacterias, hongos, virus, nematodos y protozoarios, implica el mejoramiento de los cultivos, al proteger las plantas del deterioro producido por insectos plaga. En la naturaleza, los hongos entomopatógenos (entomon: insecto, pathos: enfermedad, gennan: engendrar) pueden eliminar o controlar las plagas y constituyen, además el grupo de mayor importancia del control biológico, algunos géneros más importantes están: Metarhizium, Beauveria, Isaria y Lecanicillium. Los conidios son las unidades infectivas más importantes en los hongos entomopatógenos y una técnica para su producción es el cultivo en soporte sólido. Recientemente los hongos entomopatógenos han cobrado interés por la posibilidad de producirlos masivamente y de formularlos en preparados estables que permiten su almacenamiento por largo tiempo, preservando su viabilidad e infectividad. Además, brindan la oportunidad de comercializarlos como micoinsecticidas y con ello disminuir el uso de plaguicidas químicos, los cuales perjudican negativamente el medio ambiente. En virtud de este hecho, se justifica el interés por los estudios que buscan encontrar medios de cultivo o sustratos eficientes para su multiplicación en gran escala.

Palabras clave: Hongos entomopatógenos, Producción de Conidios, Control de Plagas.

 

ABSTRACT.

 

The controlled application of biological control agents such as: bacteria, fungi, viruses, nematodes and protozoa, involves the improvement of crops, to protect plants from damage caused by insect pests. In nature, entomopathogenic fungi (entomon: insect, pathos: illness, gennan: breed) can eliminate or control pests and are also the most important group of biological control, some more important genera are: Metarhizium, Beauveria, Isaria and Lecanicillium. Conidia are the most important infective units in entomopathogenic fungi and technique for its production is the solid culture medium. Entomopathogenic fungi have recently gained interest in the possibility of producing massively and formulate preparations allow stable storage for a long time, preserving its viability and infectivity. They provide the opportunity to market them as myco-insecticides and thus reduce the use of chemical pesticides, which adversely harm the environment. Under this, is justified the interest by studies that seek to find efficient means of cultivation or substrates for large-scale multiplication.

Keywords: Entomopathogenic fungi, Conidia production, Pest control.

 

REVISIÓN.

 

Hongos entomopatógenos

Uno de los factores que limita la producción de los cultivos son las plagas agrícolas. El uso indiscriminado de insecticidas sintéticos ha traído como consecuencia la selección de individuos resistentes, el resurgimiento de nuevas plagas y la contaminación ambiental (Gindin y col., 2009; Shah y Pell, 2003). El manejo integrado de plagas (MIP), se basa en principios totalmente ecológicos, considera todo el agro-ecosistema en su conjunto. Como tal, comprende la aplicación armónica de diferentes métodos de control, como la lucha biológica y las prácticas culturales que requiere el cultivo, teniendo en cuenta los niveles poblacionales de las plagas y enfermedades a controlar, la presencia de los bio-reguladores naturales, las etapas fenológicas del cultivo y las condiciones ambientales presentes (Alatorre-Rosas, 2006).

Uno de los componentes del MIP es el control biológico de las plagas agrícolas mediante parasitoides, predadores (entomófagos) y organismos entomopatógenos que pueden ser hongos, bacterias, virus, nemátodos y protozoarios. Todos los insectos son susceptibles de ser afectados por algún hongo, la mayor parte de los insectos que atacan a las plantas cultivadas tienen enemigos naturales que los parasitan y matan, produciendo así una reducción considerable en su población (Elizalde–Blancas, 2006; Jackson y col., 2010). El uso de hongos entomopatógenos (HE) para el control de tales insectos constituye, por lo tanto un componente importante, siendo muchos los hongos mencionados en diversos estudios que se usan para este propósito. Los hongos como Beauveria spp., Metarhizium anisopliae, Lecanicillium (Verticillium) lecanii, Isaria (Paecilomyces) spp., son comunes en el campo. Estos hongos tienen un amplio rango de hospederos y se han utilizado para controlar diversas plagas en diferentes lugares (Butt y col., 2001; Glare 2004; Jackson y col., 2010).

Las principales ventajas de los HE son (Kamp y Bidochka, 2002; Glare, 2004):

  1. Presentan grados variables de especificidad, pueden ser específicos a nivel de familia o especies muy relacionadas.
  2. Si el entomopatógeno encuentra las condiciones adecuadas para introducirse y colonizar un ecosistema, se reproduce y renueva en forma continua, es decir, se vuelve persistente, haciendo innecesarias nuevas aplicaciones.
  3. Se pueden aplicar mezclas de hongos entomopatógenos con dosis subletales de insecticidas, logrando efectos sinérgicos superiores a los logrados con aplicaciones de cada producto por separado.
  4. No contaminan el medio ambiente ni afectan al hombre u otros animales superiores.
  5. Cuando el hongo no llega a causar la muerte directamente, se presentan efectos secundarios que alteran el desarrollo normal del ciclo de vida del insecto.

Pero también presentan algunas desventajas como (Boucias y Pendland, 1998; Cañedo y Ames, 2004; Glare, 2004):

  1. Sensibilidad a la variación de las condiciones climáticas como temperaturas extremas, desecación y luz ultravioleta.
  2. No matan instantáneamente. Alcanzan buenos niveles de control entre una y tres semanas después de la aplicación, dependiendo de la plaga y del ambiente.

¿Cómo actúan los HE?

Los hongos entomopatógenos como agentes de control biológico se utilizan en diferentes países, como una alternativa viable para regular los insectos fitófagos que afectan cultivos de importancia económica dentro de un programa de manejo de plagas (Alatorre-Rosas, 2006). La mayoría de los bioplaguicidas elaborados con base en HE comercialmente disponibles en el mercado incluyen cepas de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Isaria (Paecilomyces) fumosorosea; estas especies producen una cantidad considerablemente grande de conidios asexuales en un cultivo, así como en los insectos infectados, lo que facilita la dispersión en el campo (Butt y col., 2001; Glare, 2004).

Los conidios (esporas asexuales) son responsables de la infección y se dispersan en el medio ambiente debido a las corrientes del viento, o bien por el mismo insecto que se encuentre infectado al entrar en contacto con uno sano. Cuando los conidios están sobre la cutícula de un huésped, se fijan y germinan, iniciando una serie de cascadas de reacciones de reconocimiento y activación de enzimas, tanto por el huésped como por el hongo (Boucias y Pendland, 1998; Cañedo y Ames, 2004; Montesinos-Matías y col., 2011). La enfermedad producida por hongos se llama micosis. Elizalde–Blancas, (2006) menciona que el desarrollo de la micosis puede ser llevado a cabo en tres fases descritas a continuación (Figura 1):

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Figura 1. Estructura y composición de la cutícula de insectos y forma de penetración de hongos entomopatógenos (modificado de Hajek y St Leger, 1994).

Adhesión y germinación de la espora en la cutícula del insecto.

El proceso de adhesión, dependiendo del hongo, puede ser un fenómeno específico o no específico. Mientras que la germinación de las esporas es un proceso mediante el cual una espora emite uno o varios pequeños tubos germinativos que al crecer y alargarse da origen a las hifas que penetran la cutícula, este proceso depende de las condiciones de humedad y temperatura ambiental. También puede producir una estructura llamada apresorio, la cual ayuda en la perforación de la cutícula. El éxito de la germinación y penetración no dependen necesariamente del porcentaje de germinación sino del tiempo de duración de la germinación, agresividad del hongo, tipo de espora y susceptibilidad del hospedante (Shah y Pell, 2003; Elizalde-Blancas, 2006).

Colonización del hemocele.

Ésta penetración por parte de la hifa es el resultado de la degradación enzimática de la cutícula y la presión mecánica ejercida por el apresorio. Además, depende de las propiedades de la cutícula, grosor, presencia de sustancias nutricionales y antifúngicas (Elizalde-Blancas, 2006), así como del estado de desarrollo del insecto. El integumento o tegumento; formado por una sucesión de capas, de adentro hacia afuera éstas son: membrana basal, epidermis o hipodermis y cutícula (epicutícula y procutícula) es degradada por los hongos mediante enzimas como proteasas, aminopeptidasas, lipasas, esterasas y quitinasas (Montesinos-Matías y col., 2011).

Desarrollo del hongo que resulta en la muerte del insecto.

Luego de que llegue al hemocele, el hongo puede evitar la defensa inmune del insecto produciendo células parecidas a levaduras, llamadas blastosporas, que se multiplican y dispersan rápidamente desarrollando protoplastos, elementos discretos ameboideos, sin pared celular que no son reconocidos por los hemocitos del hospedante (Pérez, 2004) y produciendo micotoxinas (Glare, 2004). La dispersión de éstos en el hemocele depende de la especie del hongo.

Los HE, además, pueden infectar a los insectos a través de las aberturas corporales como son cavidad bucal, espiráculos y otras aberturas externas. Las esporas pueden germinar rápidamente en estos ambientes por ser húmedos. Cuando lo hacen en los fluidos digestivos, en este caso, el insecto no muere de micosis sino a causa de las toxinas (Boucias y Pendland, 1998).

¿Cómo se producen los HE?

Actualmente hay tres sistemas usados para la producción de hongos entomopatógenos: el cultivo sólido, cultivo líquido y cultivo bifásico;  siendo el cultivo sólido el método que se hablará en los siguientes subtemas. Las unidades infectivas más efectivas son los conidios, pero no hay un conocimiento universal de un factor que influya en la obtención de esporas, sin embargo, se han reportado diferentes trabajos de investigación que conllevan a la mejoría en el rendimiento y esporulación de hongos entomopatógenos. Dentro de las variables estudiadas se encuentran la producción de conidios en diferentes sustratos orgánicos y sintéticos, atmósferas enriquecidas con O2 o CO2, los porcentajes de humedad del sustrato y proporciones de texturizante, efecto del tamaño de partícula del sustrato, efecto del tipo de reactor, entre otras.

Recientemente Angel-Cuapio y col., (2015) reportaron un estudio de porosidad en cultivo en soporte sólido para la producción de conidios de dos cepas de Isaria fumosorosea en mezclas de arroz precocido (AP) y lirio acuático (LA). Encontraron para la cepa I. fumosorosea CNRCB1 un rendimiento de 1.6×109 conidios/gasi y para la cepa I. fumosorosea ARSEF3302 de 7.3×109 conidios/gasi con valores de porosidad (ε) de 0.34 y 0.36, respectivamente. Además, los parámetros de infectividad contra larvas de Galleria mellonella no se modificaron. Es el primer reporte en usar lirio acuático como texturizante en cultivo sólido para modificar la porosidad, siendo un parámetro clave en la producción de conidios de I. fumosorosea.

Para evaluar la producción de conidios y su calidad en Metarhizium anisopliae var. Lepidiotum Tlecuitl-Beristain y col. (2010) reportaron diferentes medios de cultivo que contienen harina de arroz o de avena como fuente de carbono y peptona de carne como fuente de nitrógeno (g/L), incubando a 28 °C: a) harina de arroz 33.3; b) harina de avena 33.3; c) harina de arroz 33.3 y peptona 10; y d) harina de avena 33.3 y peptona 10. La peptona incrementó los rendimientos de conidios independientemente del sustrato utilizado; sin embargo, los rendimientos más altos fueron obtenidos usando el medio de harina de avena. Además, se determinó el efecto del O2 en la producción de conidios usando un medio avena-peptona y se estudió en una atmósfera normal (21% O2) y pulsos enriquecidos de oxígeno (26% O2) con recambios cada 24 h; la máxima producción de conidios (4.25×107 conidios/cm2) se obtuvo usando pulsos con 26% O2 después de 156 h de cultivo, que fue mayor al 100% con respecto a los niveles de conidios producidos bajo una atmósfera normal. El rendimiento de conidios por gramo de biomasa fue 2.6 veces mayor con 26% O2 (1.12×107 conidios/mg). Por otro lado, los parámetros de calidad de conidios, tales como germinación e hidrofobicidad no muestran diferencias significativas (a =0.05) entre estos tratamientos.

Otra investigación enfocada en la producción de conidios y amilasas de B. bassiana, es la realizada por Garza-López y col. (2012), que describen el cultivo sólido de este hongo entomopatógeno utilizando arroz como soporte sólido y fuente de carbono, con un inóculo de 1×106 conidios por gramo de sustrato seco inicial (gssi), además la adición de una solución de extracto de levadura que suplementa la fuente de nitrógeno y cofactores. En este trabajo se usó arroz como sustrato para comparar el efecto de dos composiciones de atmósferas, una normal y otra enriquecida con CO2 (5%). La máxima producción de conidios por gssi se obtuvo con la atmósfera normal (1.14X109 conidios/gssi), mientras que con la presencia de CO2, la producción de conidios disminuyó hasta 85% (1.8X108 conidios/gssi). Sin embargo, la actividad amilasa se incrementó hasta tres veces (16.58 UI/gssi) con la atmósfera que contenía dicho gas con respecto a la atmósfera normal (5.41 UI/gssi).

Por otro lado, para estudiar el efecto de la humedad y el tamaño de inóculo en la esporulación de B. bassiana, Nuñez-Gaona y col. (2010) usaron salvado de trigo (fuente de carbono) y bagazo de caña (texturizante) en diferentes proporciones (% peso/peso): 100/0, 70/30, 50/50, 30/70. Se evaluaron diferentes contenidos de humedad (66, 75 y 80%) y se estudiaron varios niveles de inóculo (1X106, 6X106 y 5X107 conidios/gss),  con una temperatura de incubación de 28°C. Se alcanzó un rendimiento máximo de 1.18X1010 conidios/gss en el CSS usando salvado de trigo con 66% de humedad y actividad de agua de 1 (aw =1); este rendimiento disminuye en orden de magnitud al incrementar el contenido de humedad o con la adición de bagazo de caña. Por otro lado, en CSS usando salvado de trigo (66% humedad), se determinó el tiempo para obtener un rendimiento de 1X1010 conidios/gss, que se conoce como t10, que puede predecirse usando un modelo considerando el tamaño de inóculo y rendimientos máximos. De esta manera, el t10 fue de 285 h con un inóculo de 1X106 conidios/gss, sin embargo, el t10 disminuye a 232 h y 148 h para un inóculo de 7X106 y 5X107 conidios/gss, respectivamente.

¿Y la calidad de los conidios?

Los parámetros de calidad de hongos utilizados para el control de insectos plaga se realizan sobre el producto final, es decir, sobre el formulado que se aplicará en campo (Alatorre-Rosas, 2006). El propósito del control de calidad es el de llevar a cabo pruebas que predigan el funcionamiento del enemigo natural en campo, además de detectar alguna irregularidad en los sistemas de producción de conidios (Berlanga-Padilla, 2006).

Viabilidad

La viabilidad es la medida de la cantidad de estructuras (conidios) que tengan la capacidad de germinar, expresada en porcentaje. El estándar recomendado para la utilización de hongos entomopatógenos como agentes de control biológico es de una viabilidad mayor del 80% (Berlanga-Padilla, 2006). La viabilidad o proporción de conidios vivos disminuye con el tiempo, esto depende de las condiciones en las cuales son almacenados, esta prueba debe ser realizada al momento de la extracción y formulación del material, a diferentes intervalos de tiempo durante el periodo de almacenamiento y antes de ser usado. De hecho, diferentes factores nutricionales y factores ambientales como la temperatura, luz y pH afectan la viabilidad, germinación, crecimiento vegetativo y esporulación (De la Torre, 2006).

Las formulaciones a base de HE tienen un tiempo de vida media entre 6 y 12 meses, una de las razones por el cual presentan un tiempo corto es su débil estabilidad a altas temperaturas (Kim y col., 2010). Sin embargo, es posible que la edad y condiciones del inóculo usados para almacenar, puedan contribuir en la viabilidad y estabilidad morfológica en periodos largos (Borman y col., 2006).

Germinación

La germinación es la emergencia del tubo germinativo a partir de un conidio. Se considera un conidio germinado, cuando el tamaño del tubo germinativo es mayor al ancho del conidio (Ibrahim y col., 2002). Las condiciones nutricionales y la temperatura son factores que afectan la germinación Una germinación rápida ayuda a tener una mayor probabilidad de éxito en el campo, ya que los aislamientos con una lenta germinación están en desventaja porque están expuestos a las condiciones desfavorables más tiempo lo cual reduce su viabilidad en el campo (Fernández-Rosas, 2006). Se debe notar que la germinación no garantiza la viabilidad de los conidios, por lo que ambas pruebas son complementarias.

Hidrofobicidad

La hidrofobicidad de los conidios es un concepto general a nivel físico, es una propiedad de la superficie de los conidios que permite eventualmente asociarse a sustratos u hospederos (Jeffs y Khachatourians, 1997). De hecho, la hidrofobicidad de la superficie de los microorganismos es fundamental para su adhesión a las superficies con las que interactúan (Le-Tian y col., 2010). En el caso de los conidios, la hidrofobicidad es el producto de una capa sobre la superficie muy bien organizada de estructuras proteicas en forma de varillas (rodlets) (Kim y col., 2010). Las principales proteínas que constituyen los “rodlets” son las hidrofobinas.

Infectividad

Así también, los bioensayos realizados en laboratorio son comúnmente utilizados para seleccionar cepas; subsecuentemente se recomienda realizar pruebas en campo y estudios relacionados a la producción masiva, formulación y propiedades de almacenaje (Vega y col., 2012).

CONCLUSIÓN.

 

Los micoinsecticidas son una alternativa viable para ser utilizados como agentes de control biológico en los cultivos agrícolas, estos productos elaborados con base en hongos entomopatógenos son considerados organismos de importante valor ecológico al desempeñar funciones de regulación sobre insectos considerados plaga en el sector agrícola, debido a que su aplicación permite mantener la productividad del campo sin contaminarlo y sin poner en riesgo la salud de la población que entra en contacto directo o en forma indirecta con estos insumos, en este sentido, la intervención de los micoinsecticidas está dando un cambio de nuestras comunidades y/o sociedades porque de alguna manera el beneficio obtenido al aplicar estos formulados genera menor deterioro del medio ambiente y con ello la preservación del área.

 

REFERENCIAS.

 

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Yolanda Escamilla-Lozano, María José Serrano-Maldonado, Alejandro Angel-Cuapio

Tecnologico de Estudios Superiores del Oriente del Estado de México. División de Ingeniería Ambiental, Paraje de San Isidro S/N, Barrio de Tecamachalco, 56400, Los Reyes Acaquilpan, Estado de México.

Universidad Autónoma Metropolitana-Unidad Iztapalapa. Departamento de Biotecnología. San Rafael Atlixco 186, Vicentina, 09340, Iztapalapa, Ciudad de México.

 

* Autor para la correspondencia: M. en B. Alejandro Angel Cuapio

  E-mail: angelcuapio@yahoo.com.mx           Tel. 55-68-78-90-32

 

Estabilización estructural del a enzima lacasa del hongo Trametes versicolor por métodos computacionales.

 

 

Structural stabilization of laccase enzyme of

      trametes versicolor fungus by computational methods.

Herrera-Zuñiga L. D.*

Tecnológico de Estudios Superiores del Oriente del Estado de México, Paraje de San Isidro S/N Barrio de Tecamachalco, Los Reyes Acaquilpan,

 

RESUMEN.

Este trabajo se enmarca en el campo de la ingeniería de las proteínas con el objetivo de proponer mutantes que adquieran estabilidad estructural ante condiciones extremas, y utiliza a la DM como uno de sus instrumentos de validación. De esta manera, presentamos los resultados obtenidos de métodos computacionales donde la técnica de simulación por DM ha servido para investigar los cambios estructurales locales asociados a mutaciones puntuales en la enzima lacasa del hongo Trametes versicolor. El diseño de las mutantes se enfocó en introducir puentes salinos potenciales en la superficie de la proteína, que pudieran tener la capacidad de incrementar la resistencia estructural de dicha proteína a través de las interacciones electrostáticas resultantes. Nuestro trabajo se encuentra cimentado en la selección de los modelos de la proteína mutante para los que su energía estructural esté por debajo de la de wtTv, calculas mediante algoritmos de MM-PBSA a tres temperaturas diferentes.

Palabras clave: Lacasa,, Dinámica Molecular , MM-PBSA, Modelado, Energía, Temperatura, Mutante.

 

 

ABSTRACT.

 

This work is part of the field of protein engineering in order to propose structural stability on protein mutants under extreme conditions,, we use the DM as one validation instruments. Thus, we present the results of computational methods where DM simulation technique has been used to investigate the local structural changes associated to one mutation on fungal Trametes versicolor laccase enzyme. The design of mutant focused on introducing a potential surface salt bridges on the protein, which may have the ability to increase the structural strength of said protein through the resulting electrostatic interactions. Our work is founded on the selection of the protein mutant models for its structural energy is below that of wtTv, algorithms calculate by MM-PBSA at three different temperatures.

Keywords: Laccase , Molecular Dynamics , MM-PBSA , Modeling , Energy, Temperature, Mutant.

 

 

INTRODUCCIÓN.

 

Las proteínas son grandes estructuras moleculares que actúan como actores esenciales de los principales procesos intra- e inter- celulares: contribuyen a mantener la estructura global, son las moléculas responsables del trabajo mecánico en las celulares, son agentes claves en la comunicación celular, regulan la expresión génica, constituyen los elementos claves del sistema inmune y actúan como catalizadores de por lo menos el 90% de todos los procesos metabólicos.

Desde un punto de vista químico, las proteínas corresponden a polímeros poliamídicos ensamblados por una combinación de 20 aminoácidos, presentan varios tamaños que gozan de una gran flexibilidad debido a la posibilidad de rotación de los enlaces sencillos vecinos al de amida o peptídico (los ángulos ψ).

La codificación para nuestras proteínas viene inscrita en el código genético que heredamos de nuestros antepasados, dicha codificación es mejor conocida como secuencia polipeptídica o de aminoácidos, misma que determina la estructura tridimensional, que, a su vez, marca la funcionalidad de la proteína.

Conocer la estructura de las proteínas nos facilita la comprensión del modo en que trabajan y, por tanto, de cómo podemos operar sobre ellas. Este conocimiento constituye el paradigma central de la biología estructural y del diseño racional de ellas, razón que ha empujado el desarrollo de proyectos de investigación con base en la estructural de proteínas por todo el mundo.

Enzima Lacasa

La enzima lacasa (eLa) es una proteína perteneciente a la familia de las multicobre oxidasas ya que presenta iones de cobre inmersos en el sitio catalítico y he indispensables para su función catalítica, dichos átomos metálicos se encuentran empaquetados por la conjugación de tres dominios estructurales (ver figura 1). La enzima consiste de un polipéptido de alrededor de 500 residuos de aminoácido; un peso molecular de aproximadamente de 54 kDa que incluye una porción de carbohidratos, Brooks BR y col (1983), Durão Py col (2006), Lindley P. F. (2004). La eLa permite la reducción de oxígeno molecular generando una molécula de agua, la cual se acompaña algunas veces por la acción oxidante de sustratos sintéticos para acelerar la catálisis.

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Figura 1. Andamiaje de la enzima lacasa del hongo TrameteswtTv. A) Representación en listones para la estructura tridimensional, en color azul, rojo y blanco se aprecian los tres dominios estructurales de la esta enzima. B) Representación esquemática del ensamble para la enzima lacasa, los rombos apresan ser los dominios estructurales presentados en A. Las esferas de color ocre en A y B presentan la ocupación de los representan los átomos de cobre dentro del sitio activo.

El rol natural de (eLa) es generar la despolimerización (ruptura oxidativa) de la lignina, un elastómero con arreglos de cadenas entrecruzadas o matriciales de moléculas de monolignoles que protege y genera rigidez a organismos vegetales Riva S. (2006).

Los átomos de cobre y el sitio activo

Típicamente la enzima lacasa contiene tres tipos de átomos para cobre, debido a su clasificación espectroscópica y de UV, un cobre lejano, denominado como tipo I (Cu_1) más tres cobres en un clustertrinuclear, de los cuales uno es tipo II (Cu_2) y dos son tipo III (Cu_3, Cu_4), Bertrand T. yclo (2002), Lindley P. F. (2004) y Salomon E. y col (1996).

Tipo I cu :     Máximo de absorción en la región de luz visible encontrado cuando  e> 3000 M -1 cm-1 a 600 nm.

Tipo II o normal cu : Absorción de luz indetectable.

Tipo IIl cu :   Presenta una absorción fuerte en el UV cercano a 330 nm.

La aplicación práctica e industrial para el uso de la enzima lacasa es variada y deriva del poder biocatalítico natural y específico por realizar la ruptura de la molécula lignina (degradación de fenoles), la aplicación va desde degradación de residuos vegetales para la producción de biocombustibles como el bioetanol o el biodiesel, hasta el desarrollo de detectores de drogas, pasando por la industria alimentaria y cosmética, ejemplo: en la clarificación del vino o eliminación de compuestos recalcitrantes, Mayer A. F. y Staples R. C. (2002), Durão P. y col (2006) y Piontek K. y col. (2002). No obstante, el verdadero proceso que atrae a la comunidad científica es la capacidad intrínseca de esta enzima por degradar la matriz lignolítica (deslignificar) de cuerpos lignocelulósicos, en conjunto con moléculas dependientes del tipo de reacción, figura 2, . Mayer A. F. y Staples R. C. (2002).

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Figura 2. Esquema del ciclo catalítico para el sistema lacasa-mediador-sustrato. Dentro del ciclo natural para la enzima lacasa el mediador suele ser el propio oxígeno en su forma molecular. En este caso se presenta un mediador sintético llamado ABTS, el cual acelera la reacción de óxido-reducción hasta en un 45%, Piontek K. y col (2009).

Simulación computacional: poderosa herramienta

Es sabido que los experimentos juegan un rol importante en la ciencia, siendo la riqueza de sus resultados los que proveen las bases del entendimiento dinámico sobre la química de la vida. No obstante, los experimentos no son parte de toda la historia y son posibles sólo cuando hay una interconexión entre modelos y teoría. Por ello es que la simulación computacional se encuentra coligada entre teoría y experimentación. La esencia de la simulación radica en el uso de un computador para modelar un sistema físico, mediante modelos matemáticos y donde los resultados suelen interpretarse en términos de sus propiedades físicas.

Los parámetros de dicho modelo y sus diferentes cantidades físicas pueden, en un sentido, ser medidas sobre el computador, justificando así el término ‘experimento computacional’.

Por otro lado el modelado molecular es un término general que engloba métodos teóricos y técnicas computacionales que modelan o imitan el comportamiento de moléculas desde pequeños sistemas químicos hasta grandes moléculas biológicas mediante técnicas de DM, Meller J. (2001)

Resistencia térmica

Como las enzimas termofilicas juegan un rol prometedor en la industria biotecnológica donde en su mayoría un ambiente a altas temperaturas es requerido para el proceso de catálisis, es de gran importancia adquirir una aproximación racional que sustente él como un enzima se adopta a condiciones fuera de su rango fisiológico.

Numerosos trabajos sobre el origen fisicoquímico de la estabilidad térmica han sido realizados, y estos sugieren una variedad de factores pueden contribuir a mejorar la estabilidad, tales como una composición de aminoácidos dada, pares iónicos, puentes de hidrógeno, puentes salinos, entre otros. Entre estos efectos uno de los más frecuentemente reportados a nivel estructural entre proteínas mesófilas y termófilas es el número de puentes salinos. Al parecer entonces los puentes salinos pueden tener un papel considerable en la mejora de la estabilidad general. Convirtiéndose así los puentes salinos en nuestro principal objetivo para estudiar la estabilización térmica.

MATERIALES Y MÉTODOS.

 

La metodología utilizada en el presente trabajo se puede observar en el diagrama de flujo 1.

La sistemática de la tesis consistió con llevo una serie de pasos los cuales algunas veces se realizaron hasta por quintuplicado. Lo primero consistió en encontrar una lacasa a la cual se tuviera acceso con la finalidad de corroborar los cálculos teóricos de manera experimental.

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Diagrama de flujo 1. Protocolo de trabajo seguido para la minimización y la simulación del sistema. A) protocolo general del trabajo de tesis. B) protocolo de minimización. C) protocolo de simulación. Líneas de un mismo color implican ciclos, donde los ciclos se leen de adentro hacia afuera. Líneas de distinto color en un ciclo refieren una probable iteración sobre el mismo paso.

El paso siguiente fue realizar el modelo tridimensional de la secuencia de aminoácidos para dicha enzima, seguido se analizó la calidad estereoquímica del modelo con el software computacional ANOLEA y PROSAII, los cuales no se presentan puesto que ya se han discutido informes atrás. Una vez analizado el modelo. De manera seguida se realizó la búsqueda de aminoácidos con capacidad de ser mutados; una vez determinados estos aminoácidos y realizadas las mutaciones se prosiguió a realizar la minimización de energía para cada mutación. Como último paso se realizó la dinámica molecular de las proteínas que presentaron una disminución de la energía considerable con respecto a la enzima nativa, así como sus análisis, bajo la finalidad de obtener las proteínas.

Condiciones de la minimización y protocolo para la simulación por DM

 

Los lanzamientos de minimización y simulación por DM se realizaron con el paquete computacional NAMD 2.7 y se visualizaron con VMD 1.8, Banci L. (2003) y Bertrand T., y col . (2003), ya mencionado algunas páginas atrás. El sistema estudiado en la primera parte de los resultados, así como en ésta, comprende a la enzima lacasa + solvente con aproximadamente 80, 000 átomos (ver figura 8). La minimización y simulación se llevaron a cabo en un con ayuda del Cluster Aitzaloa situado en el laboratorio de supercómputo de la Universidad Autónoma Metropolitana.

El protocolo para la minimización tuvo lugar como a continuación se explica y bajo los siguientes criterios de simulación. Un doble cut-off para calcular las interacciones a corta distancia de 10 a 14 Å con punto de inflexión en 10 Å, PME para las interacciones a larga distancia con un vectores constantes a 85, 90 y 70Å a lo largo de los ejes x, y, y z respectivamente, más 150,000 pasos de minimización, aplicando restraints al sitio activo a cada etapa de minimización.

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Figura 3. Sistema del Modelo lacasalTv + solvente con un aproximado 80, 000 átomos. Los puntos representan las moléculas de solvente con un espesor de 10 Å y un total 70,000 átomos. Las esferas color ocre representan los átomos de cobre. Y en gris se muestra la conformación tridimensional nativa para wtTv con aproximadamente 10,000 átomos.

Este tratamiento se realizó para cada una de las proteínas (1 silvestre y 10 mutaciones). La estrategia de minimización para evitar que el sistema colapsara fue realizada de la siguiente forma. Primero se tomó la proteína con las moléculas de agua co-cristalográficas provenientes del archivo PDB Se minimizó, después se construyeron las mutantes, paso seguido la molécula se solvató y se agregaron contraiones para obtener un sistema neutro.

Paso siguiente el sistema se trata de afuera hacia dentro, es decir, se minimizó el solvente manteniendo fija la proteína, seguido se minimizó el solvente y las cadenas laterales de la proteína, manteniendo fija la cadena principal y el sitio activo, y por último se minimizó el sistema exceptuando el sitio activo el cual, como anteriormente, se mantiene fijo durante todas las etapas de minimización. El algoritmo de minimización se puede apreciar mejor en el diagrama de flujo.

Seguido a la minimización se lanzaron las once simulaciones por MD. Dicha simulación fue lanzada para obtener datos de 5 ns (5 x 106 femtosegundos) de movimientos de la proteína. Como ya se mencionó, las simulaciones se llevaron a cabo con el campo de fuerzas CHARMM32b all_27 con las correcciones CMAP. Dentro de los parámetros de cálculo a tener encuentra al momento de correr nuestras simulaciones se pueden mencionar a groso modo los siguientes:

Particle Mesh Ewald con la finalidad de realizar el cálculo electrostático de largo alcance esto bajo los mismos criterios de minimización, un doble cut-off de 13 a 11 Å con un punto de inflexión en 12 Å para las interacciones no enlazantes de corto alcance, este doble cut-off es el recomendado por usuarios experimentados y cercanos a los desarrolladores de NAMD, los cuales informan que un cut-off como el presentado aquí puede dirigir la simulación a obtener mejores resultados en el cálculo de las energía no enlazantes cuando se modelan proteínas con aproximadamente 40,000 átomos o más.

La simulación por DM se lanzó como un modelamiento de Langevin bajo un ensamble NPT isotérmico-isobárico a una P=1 atm, y una T=298, 323 y 348 K constantes a cada una de las simulaciones dadas. Tamaño de paso acorde a los 2 para integrar las ecuaciones de movimiento, necesario para inmovilizar los enlaces hacia los átomos ligeros (hidrógeno), lo cual es nuestro caso. La simulación para las mutantes se realiza manteniendo el sitio activo (SA) restringido bajo un oscilador armónico utilizando COLVARS MODULE contenido en NAMD.

 

RESULTADOS.

 

Como ya ha venido comentando el modelado molecular, la búsqueda de rotámeros, la exploración de la superficie, así como la construcción de mutantes para wtTv se realizó con software computacional MOE. Si bien MOE puede realizar cálculos físicos, matemáticos y estadísticos tales como: minimización de energía, docking y simulación por DM, hemos decidido en principio realizar la minimización y simulación por DM con el software computacional NAMD –NAnoscaleMolecular Dynamics- debido a su alta eficiencia para trabajar en paralelo (asignación de tareas en multiprocesadores), y VMD –Visual Molecular Dynamics- por ser un paquete computacional explícitamente diseñando para realizar simulación por DM, y en conjunto por su alto contenido de citas en artículos de talla internacional con al menos 30% del total de artículos referidos a DM, además de ser un software de libre acceso u “open source” en inglés con probabilidades de ser instalado en el ClusterAitzaloa, supercomputadora con540 procesadores Quad-Core (2160 CORES) localizado en el Laboratorio Central de Supercómputo de la UAM-Iztapalapa.

Relajamiento y dinámica molecular de las mutantes

De las treinta y dos mutantes encontradas sobre wtTv, diez de éstas fueron tomados para simulación por DM. Los criterios para eliminar dieciocho mutantes de treinta y dos propuestas se encuentran ligados directamente con las características estructurales y energéticas para cada una de las mutaciones.

El criterio de eliminación estructural, se aplicó a cuatro de las dieciocho mutantes ya que estas mutaciones correspondían a residuos de glicina importantes para guardar la conformación de loops cortos (cuatro a cinco residuos), mediante experimentos de mutación dirigida encontrados en la literatura, se ha mostrado que residuos de glicina dentro de loops cortos son imprescindibles para el correcto pegamiento de las proteína.

La exclusión energética tomó un curso natural dirigido por el tiempo para poner a punto la simulación por DM (inclusión de parámetros al campo de fuerza y archivos de topología, preparación de la proteína, potocos de simulación…), así como por el mismo tiempo que tarda en correr una simulación por DM. La energía de cada una de las doce proteínas mutadas (proteínas problema), la proteína nativa wtTv, las mutaciones correspondientes a testigos negativos y un testigo positivo, se pueden apreciar en la grafica1.

El testigo positivo hace alusión al trabajo realizado in vitro por el Dr. Polaina y colaboradores sobre la -glucosidasa (b-glu) insertando exitosamente un par iónico mediante mutación dirigida, con la finalidad de incrementar la resistencia estructural de la enzima.

Después de evaluar y analizar en un primer plano bajo criterios energéticos (MMPB-SA) las mutantes líderes con posibilidad de ser mutadas se muestran en la gráfica 1. En la figura 1 se pueden apreciar los cambios estructurales energéticos sufridos por cada una de las proteínas.

Para éstas se observó que la energía evaluada alcanzo aproximados de -300kcal/mol. para una diferencia entre mutación y proteína silvestre.

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Gráfia1. Promedio y desviación estándar de la energía libre como una función de la temperatura y mutaciones. MM-PBSA vs T

La gráfica 1 muestra la energía libre ( DG) calculada mediante MM-PBSA, éste cálculo fue generado mediante la combinación de parámetros tales como mecánica molecular (EMM), resolución de la ecuación de Poisson-Boltzmann (PB) y la energía calculada sobre el área accesible al solvente (ASA). En la presente gráfica se tabuló el cambio energético y desviación estándar para cada una de las mutantes encontradas, en esta se observa que un aumento en la temperatura produce una disminución de la energía libre, ya que al graficar la energía para la simulación a 348K su promedio se muestra por encima de la simulación ejecutada a 323K y 298K. De la gráfica 1 se desprende que la mutación con mejor energética comprada con wttv es a71r.

REFERENCIAS.

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Herrera-Zuñiga L. D. *

Tecnológico de Estudios Superiores del Oriente del Estado de México, Paraje de San Isidro S/N Barrio de Tecamachalco, Los Reyes Acaquilpan,

* Autor para la correspondencia: M. en B. Leonardo D. Herrera Z.

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